革蘭氏染色 Gram Stain

細菌學最重要的第一步鑑別染色法 — 原理、步驟、判讀與臨床應用
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1什麼是革蘭氏染色？

革蘭氏染色（Gram stain）是微生物學中最基礎、最常用的鑑別染色法（differential stain），由丹麥醫師 Hans Christian Gram 於 1884 年發明。它依據細菌細胞壁結構的差異，把細菌分成兩大類：

革蘭氏陽性 Gram-positive

細胞壁含厚層胜肽聚醣（peptidoglycan），能保留結晶紫染料，最終顯現紫色／藍紫色。

革蘭氏陰性 Gram-negative

細胞壁胜肽聚醣薄、外層另有外膜（脂多醣 LPS），脫色後被番紅複染成紅色／粉紅色。

為什麼重要？ 在臨床上，從檢體（痰、血液、尿液、腦脊髓液等）做革蘭氏染色，幾分鐘內就能初步判斷感染菌的大致類別與形態，指引第一線抗生素的選擇，遠早於培養結果出來之前。

2歷史背景：Hans Christian Gram

1884 年，丹麥細菌學家 Hans Christian Joachim Gram（1853–1938）在柏林研究肺炎死者的肺組織時，意外發現某些細菌在經過結晶紫與碘液處理、再以酒精沖洗後仍能保留顏色，而另一些則會被洗去。他原本只是想讓細菌在組織切片中更容易被看見，卻無意間建立了一套沿用至今、超過 140 年的分類方法。

有趣的是： Gram 本人相當謙虛，他在原始論文中寫道：「我發表這個方法時，深知它目前仍有缺陷與不足。」沒想到這個「不完美」的方法成了微生物學的基石。

3關鍵：細胞壁結構差異

革蘭氏染色能區分兩類細菌，根本原因在於細胞壁的結構不同。理解這一點，就能理解整個染色原理。

革蘭氏陽性 (G+)

  • 厚層胜肽聚醣（20–80 nm，佔細胞壁 60–90%）
  • 含磷壁酸（teichoic acid）
  • 沒有外膜
  • 結構緻密，脫色時不易讓染料逸出

革蘭氏陰性 (G−)

  • 薄層胜肽聚醣（2–7 nm）
  • 外有外膜（LPS／脂多醣），含內毒素
  • 胜肽聚醣與外膜間有周質空間（periplasmic space）
  • 脫色時外膜的脂質被酒精溶解，染料易流失

4染色步驟（四大步驟）

標準革蘭氏染色包含四個試劑步驟。記憶口訣：「紫、碘、脫、紅」（初染 → 媒染 → 脫色 → 複染）。

STEP 1

初染 Primary stain

試劑：結晶紫 Crystal Violet（約 1 分鐘）

所有細菌都被染成紫色。

STEP 2

媒染 Mordant

試劑：碘液 Gram's Iodine（約 1 分鐘）

碘與結晶紫形成大型 CV–I 複合物，卡在細胞內，加強固色。

STEP 3

脫色 Decolorization ⚠️關鍵

試劑：95% 酒精或丙酮（數秒，最關鍵！）

G+ 保留紫色；G− 被洗成無色。時間過久 G+ 也會褪色。

STEP 4

複染 Counterstain

試劑：番紅 Safranin（約 1 分鐘）

已無色的 G− 被染成紅／粉紅色；G+ 仍維持紫色。

脫色是成敗關鍵！ 脫色不足 → G− 被誤判為 G+（假陽性）；脫色過度 → G+ 被誤判為 G−（假陰性）。這是最常見的技術誤差來源。

5染色原理：為什麼會有顏色差異？

顏色差異的核心發生在脫色步驟，由細胞壁結構決定：

革蘭氏陽性（保留紫色）

厚層胜肽聚醣在酒精作用下脫水、孔隙收縮變緻密，把大型的結晶紫–碘複合物「鎖」在細胞內出不來，因此維持紫色，複染的番紅蓋不過原本的紫色。

革蘭氏陰性（被洗成紅色）

酒精會溶解外膜的脂質，加上胜肽聚醣層薄，結晶紫–碘複合物隨之被沖出細胞，細胞變回無色；接著番紅複染，使其呈現紅／粉紅色。

一句話總結： G+ 靠「厚牆鎖色」維持紫色；G− 因「薄牆＋脂膜被溶」而失色、再被番紅染紅。

6結果判讀（顯微鏡下）

判讀時同時觀察兩件事：顏色（紫＝G+／紅＝G−）與形態排列（球菌 cocci／桿菌 bacilli；成串、成鏈、成對…）。

革蘭氏陽性球菌（GPC）

革蘭氏陽性桿菌（GPB）

革蘭氏陰性球菌（GNC）

革蘭氏陰性桿菌（GNB）

酵母菌（Yeast，非細菌）

觀察項目革蘭氏陽性革蘭氏陰性
顏色紫色／藍紫色紅色／粉紅色
球菌範例葡萄球菌、鏈球菌淋病雙球菌
桿菌範例桿菌屬、梭菌屬大腸桿菌、綠膿桿菌

7常見菌種與臨床意義

菌種革蘭氏形態常見相關疾病
Staphylococcus aureus 金黃色葡萄球菌陽性球菌・葡萄串狀皮膚膿瘍、菌血症、食物中毒
Streptococcus pyogenes 化膿性鏈球菌陽性球菌・鏈狀咽喉炎、猩紅熱、蜂窩性組織炎
Streptococcus pneumoniae 肺炎鏈球菌陽性球菌・成對（矛頭狀）肺炎、腦膜炎、中耳炎
Clostridium 梭菌屬陽性桿菌・會形成孢子破傷風、肉毒桿菌中毒、偽膜性腸炎
Escherichia coli 大腸桿菌陰性桿菌泌尿道感染、腹瀉、敗血症
Pseudomonas aeruginosa 綠膿桿菌陰性桿菌院內感染、燒燙傷感染、肺炎
Neisseria gonorrhoeae 淋病雙球菌陰性球菌・成對（咖啡豆狀）淋病
Salmonella 沙門氏菌陰性桿菌傷寒、食物中毒
Enterococcus faecalis 腸球菌陽性球菌・成對／短鏈泌尿道感染、心內膜炎、院內感染
Corynebacterium diphtheriae 白喉桿菌陽性桿菌・柵欄／中文字狀白喉
Clostridium tetani 破傷風梭菌陽性桿菌・末端孢子（鼓棒狀）破傷風
Clostridioides difficile 困難梭菌陽性桿菌・次末端孢子抗生素相關腹瀉、偽膜性腸炎
Cutibacterium acnes 痤瘡桿菌陽性桿菌青春痘、植入物相關感染
Neisseria gonorrhoeae 淋病雙球菌陰性球菌・成對（咖啡豆狀）淋病
Vibrio cholerae 霍亂弧菌陰性弧菌・逗點狀霍亂
Campylobacter jejuni 曲狀桿菌陰性桿菌・螺旋／海鷗翅狀腸胃炎、Guillain–Barré 症候群
Candida albicans 白色念珠菌（酵母菌）陽性*酵母菌・出芽／假菌絲鵝口瘡、陰道炎、念珠菌血症

* Candida albicans 屬真菌（酵母菌）而非細菌，革蘭氏染色雖呈陽性（紫色），但臨床上不以革蘭氏染色作為主要鑑別依據；此處列出供形態對照。

臨床連結： 革蘭氏陰性菌的外膜含脂多醣（LPS，內毒素），是引發敗血性休克的重要原因；其外膜也使許多抗生素較難穿透，與抗藥性密切相關。

8限制與注意事項

提醒： 抹片過厚會使脫色不均，導致同一張片子上同時出現紫色與紅色，造成判讀困難。建議使用單層、薄而均勻的抹片。

9隨堂小測驗

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Q1. 革蘭氏染色四步驟中，哪一步是區分陽性／陰性的「關鍵步驟」？
正解：脫色。脫色決定結晶紫–碘複合物是否被洗出；脫色不足或過度都會造成誤判。
Q2. 革蘭氏陽性菌在顯微鏡下呈現什麼顏色？
正解：紫色。厚層胜肽聚醣鎖住結晶紫–碘複合物，故維持紫色。
Q3. 下列何者是革蘭氏陰性菌特有、與敗血性休克相關的結構？
正解：外膜 LPS。脂多醣即內毒素，是革蘭氏陰性菌引發敗血性休克的關鍵因子。
Q4. 下列哪種細菌「不適合」用革蘭氏染色判讀？
正解：結核分枝桿菌。其細胞壁富含分枝菌酸，需用抗酸性染色（Acid-fast / Ziehl–Neelsen）。
Q5. 革蘭氏染色法是由誰發明的？
正解：Hans Christian Gram，丹麥細菌學家，1884 年發明此染色法。
Q6. 下列何者是革蘭氏染色中的「媒染劑（mordant）」，能與結晶紫形成大型複合物加強固色？
正解：碘液。碘與結晶紫形成 CV–I 複合物卡在細胞內，是媒染步驟。
Q7. 革蘭氏染色使用的「複染劑（counterstain）」是下列何者？
正解：番紅。它把已脫色的革蘭氏陰性菌染成紅／粉紅色。
Q8. 革蘭氏陽性菌細胞壁的主要成分（佔比最高）是？
正解：厚層胜肽聚醣，可佔細胞壁 60–90%，是 G+ 能鎖住紫色的關鍵。
Q9. 革蘭氏染色四步驟的正確順序為何？
正解：結晶紫 → 碘液 → 酒精脫色 → 番紅（口訣：紫、碘、脫、紅）。
Q10. 若脫色步驟時間「過久（過度脫色）」，最可能造成什麼結果？
正解：G+ 被誤判為 G−。過度脫色會把 G+ 細胞內的結晶紫也洗出，使其被番紅染紅而誤判；反之脫色不足則會把 G− 誤判為 G+。
Q11. 顯微鏡下看到「革蘭氏陰性雙球菌」位於膿細胞（白血球）內，最常見於淋病，最可能是哪種菌？
正解：淋病雙球菌。革蘭氏陰性雙球菌（GNC）、咖啡豆／腎形成對，常見於膿細胞內。
Q12. 下列哪種革蘭氏陰性菌呈「逗點／弧形」桿菌，是霍亂的病原？
正解：霍亂弧菌。革蘭氏陰性、逗點／弧狀桿菌，引起霍亂。
Q13. 在糞便抹片中看到「海鷗翅／螺旋狀」的革蘭氏陰性菌，最可能是哪一屬？
正解：曲狀桿菌。呈彎曲螺旋、兩菌相連時像「海鷗翅（gull-wing）」，是腸胃炎常見病原。
Q14. 下列哪一屬的革蘭氏陽性桿菌會形成「內孢子（endospore）」，使菌體呈鼓棒或網球拍狀？
正解：梭菌屬。如破傷風梭菌（末端孢子）、困難梭菌（次末端孢子），孢子使菌體膨大呈鼓棒狀。
Q15. 顯微鏡下呈「中文字／柵欄狀」排列的革蘭氏陽性桿菌是？
正解：棒狀桿菌。菌體呈棒狀、常以「V／柵欄／中文字」排列，染色不均呈念珠狀。
Q16. 關於 Candida albicans（白色念珠菌），下列敘述何者正確？
正解：它是真菌（酵母菌）。菌體明顯比細菌大、可見出芽與假菌絲；革蘭氏染色呈陽性，但臨床鑑別主要靠真菌培養等方法。

10參考資料與圖片來源

圖片來源與授權

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